Protocolo para germinar y conservar semillas de plantas nativas cubanas: un enfoque con rasgos funcionales de semillas

Recolección del material vegetal

Todas las metodologías que a continuación se describen deben proceder de recolecta de semillas frescas para evitar sesgos en la información obtenida; y en consecuencia, errores en la interpretación de los resultados. Para ello, se deben identificar plantas saludables de al menos tres individuos por especie, pero si es posible la recolecta debe realizarse de la mayor cantidad de individuos posibles para asegurar la variabilidad genética de la población. Se recolectará directamente de la planta madre de forma completamente al azar y de todas sus partes, solo se tomarán frutos saludables y maduros por medio de una vara telescópica o con las manos. También se pueden recolectar frutos/semillas recién caídos, sobre la superficie del suelo, para su posterior extracción (o limpieza) en el laboratorio (Torres-Arias et al., 2022Torres-Arias Y, Sánchez JA, Pernús M. 2022. Manual de semillas para la restauración de ecosistemas limítrofes al manglar. Editorial AMA, La Habana.). En todos los casos se debe tomar no más del 20% de las semillas sanas disponibles, lo que asegura que haya suficientes semillas para la regeneración natural, pero en ocasiones es especialmente crítico para especies en peligro de extinción o que producen pocas semillas y con baja viabilidad (Dayrell et al., 2016Dayrell RLC, Arruda AJ, Buisson E, Silveira FAO. 2016. Overcoming challenges on using native seeds for restoration of megadiverse resource-poor environments: a reply to Madsen et al. Restoration Ecology. 24. DOI: http://doi.org/10.1111/rec.12450.; Di Sacco et al., 2020Di Sacco A, Way M, León Lobos P, Suárez Ballesteros CI, Díaz Rodriguez JV. 2020. Manual de recolección, procesamiento y conservación de semillas de plantas silvestres. Royal Botanic Gardens, Kew e Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt.).

Extracción de las semillas

Debido a la gran diversidad de frutos que existen se emplean diversos métodos de extracción de semillas. No obstante, básicamente se utilizan dos métodos, uno para frutos secos (e.g., cápsulas, legumbres, silicuas) y otro para frutos húmedos (e.g., bayas, drupas, siconos). Las semillas procedentes de frutos secos se retiran manualmente del resto del fruto y se colocan en frascos herméticos a temperatura ambiente hasta su uso. Se recomienda nunca secar los frutos al sol para facilitar su apertura, ya que esto puede afectar la viabilidad de las semillas. En el caso de frutos húmedos conviene limpiarlos bajo agua corriente y secar a la sombra durante 72 horas. Los frutos húmedos y carnosos deben procesarse rápidamente debido a que las semillas corren el riesgo de deteriorarse con la fermentación de las cubiertas del fruto, aunque en ocasiones este proceso de fermentación ayuda a la limpieza y obtención de las semillas. Un lector interesado en conocer con mayor profundidad métodos de extracción de semillas puede revisar obras publicadas recientemente por Di Sacco et al. (2020)Di Sacco A, Way M, León Lobos P, Suárez Ballesteros CI, Díaz Rodriguez JV. 2020. Manual de recolección, procesamiento y conservación de semillas de plantas silvestres. Royal Botanic Gardens, Kew e Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt., Frischie et al. (2020)Frischie S, Miller AL, Pedrini S, Kildisheva OA. 2020. Ensuring seed quality in ecological restoration: native seed cleaning and testing. Restoration Ecology. 28: S239-S248. y Torres-Arias et al. (2022)Torres-Arias Y, Sánchez JA, Pernús M. 2022. Manual de semillas para la restauración de ecosistemas limítrofes al manglar. Editorial AMA, La Habana..

Viabilidad

Las pruebas de viabilidad se realizan para determinar el porcentaje de semillas que son viables en un lote; por ende, para determinar cuántas semillas tienen potencial para germinar y producir plántulas. Entre los métodos más extendidos, a nivel mundial, se encuentra el ensayo de corte y de tetrazolio (ISTA, 2007ISTA (International Seed Testing Association). 2007. International rules for seed testing. Bassersdorf, Zürich.; AOSA, 2019AOSA (Association of Official Seed Analysts). 2019. Rules for seed testing-principles and procedures. https://www.analyzeseeds.com/product/aosarules-volume-1-principles-procedures-2019/.), que son técnicas indirectas para determinar viabilidad de las semillas. En contraste, las pruebas simples de germinación a temperatura ambiente se consideran una técnica directa para este propósito.

Ensayo de corte

Es un método muy simple y efectivo para estimar la viabilidad (o calidad) de las semillas. Consiste en dar cortes transversales o longitudinales a la semilla con un bisturí, o con tijeras, con el fin de exponer el embrión. Se recomienda una muestra de 100 semillas escogidas al azar (Pedrini y Dixon, 2020Pedrini S, Dixon KW. 2020. International principles and standards for native seeds in ecological restoration. Restoration Ecology. 28: S286-S303.); pero se puede emplear un tamaño menor de la muestra (50, 20 o 10 semillas) en dependencia del tamaño de la recolecta (Pritchard et al., 2004aPritchard HW, Wood CB, Hodges S, Vautier HJ. 2004a. 100-seed test for desiccation tolerance and germination: a case study on eight tropical palm species. Seed Science and Technology. 32: 393-403.; Di Sacco et al., 2020Di Sacco A, Way M, León Lobos P, Suárez Ballesteros CI, Díaz Rodriguez JV. 2020. Manual de recolección, procesamiento y conservación de semillas de plantas silvestres. Royal Botanic Gardens, Kew e Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt.). Posterior al corte de las semillas, se deben examinar sus estructuras bajo la lupa o el estereoscopio. Las semillas aparentemente sanas contienen un embrión blanco y firme, y las semillas muertas presentan un embrión suave o gris indicativo de no viabilidad (Baskin y Baskin, 2014Baskin CC, Baskin JM. 2014. Seeds: Ecology, Biogeography and Evolution of Dormancy and Germination. Academic Press, New York.; Pedrini y Dixon, 2020Pedrini S, Dixon KW. 2020. International principles and standards for native seeds in ecological restoration. Restoration Ecology. 28: S286-S303.). Los resultados de este ensayo se expresan en porcentaje con relación a la cantidad de semillas cortadas. También se pueden registrar con esta técnica las semillas vacías (sin embrión) y las infestadas, estas últimas se reconocen por daños causados por los insectos en la testa (e.g., brúquidos).

Es importante señalar que, aunque existe una creencia generalizada de que las semillas con embriones blancos y firmes son viables, no todos los embriones viables presentan este color. De hecho, hay embriones frescos y viables que pueden variar desde amarillos y marrones hasta verdes, e incluso algunos presentan incrustaciones o glándulas (Fig. 1), lo que podría dar la falsa impresión de que están enfermos o muertos. Para evitar falsos negativos, es necesario que los investigadores se relacionen con la especie y con las estructuras internas de las semillas, previo a la valoración de su viabilidad (Baskin y Baskin, 2014Baskin CC, Baskin JM. 2014. Seeds: Ecology, Biogeography and Evolution of Dormancy and Germination. Academic Press, New York.; Frischie et al., 2020Frischie S, Miller AL, Pedrini S, Kildisheva OA. 2020. Ensuring seed quality in ecological restoration: native seed cleaning and testing. Restoration Ecology. 28: S239-S248.). Por último, cuando la prueba de corte solo se emplea al final del experimento de germinación para estimar la viabilidad del lote (i.e., semillas germinadas y semillas vivas no germinadas) debe hacerse con cautela, pues las condiciones de siembra y/o los tratamientos pregerminativos a los que se someten las semillas, pueden provocar pérdida de la viabilidad seminal. Según Lamont (2022)Lamont BB. 2022. Seed biologists beware: Estimates of initial viability based on ungerminated seeds at the end of an experiment may be error-prone. Plant Biology. 24: 399-403., este error es muy frecuente, y puede afectar tanto la estimación del porcentaje de germinación final con base al número de semillas viables como el porcentaje de semillas dormantes al final del experimento (semillas vivas no germinadas). Por tanto, se recomienda hacer pruebas de corte tanto al inicio como al final del experimento de germinación.

Ensayo de tetrazolio

Es uno de los métodos más completos para estimar la viabilidad de las semillas (Cottrell, 1947Cottrell HJ. 1947. Tetrazolium salt as a seed germination indicator. Nature. 159: 748.), aunque consume tiempo, destruye las semillas y requiere experiencia por los investigadores (Baskin y Baskin, 2014Baskin CC, Baskin JM. 2014. Seeds: Ecology, Biogeography and Evolution of Dormancy and Germination. Academic Press, New York.). Se puede hacer directamente con embriones aislados o semillas cortadas que se ponen en contacto con solución 2, 3, 5-trifenil cloruro de tetrazolio (TZ) (ISTA, 2007ISTA (International Seed Testing Association). 2007. International rules for seed testing. Bassersdorf, Zürich.), y se basa en la actividad de enzimas deshidrogenasas (enzimas de respiración) que producen iones de hidrógeno al ser hidratadas las semillas viables. La liberación de estos iones en las células reduce la solución de TZ incolora a una solución de 2, 3, 5-trifenil formazán (de color rojo), que tiñe tejidos metabólicamente activos (Lakon, 1949Lakon G. 1949. The topographical tetrazolium method for determining the germinating capacity of seeds. Plant Physiology. 24: 389-394.). Por el contrario, en zonas de tejidos muertos del embrión, el tetrazolio conserva su color blanco o incoloro, debido a que las enzimas han sido desnaturalizadas o degradadas (Lakon, 1949Lakon G. 1949. The topographical tetrazolium method for determining the germinating capacity of seeds. Plant Physiology. 24: 389-394.). De ahí, que la viabilidad de las semillas se determina en función del patrón de tinción del embrión y la intensidad de la coloración. Los embriones teñidos de rojo carmín o rosa intenso se clasifican como viables, mientras que los teñidos de color blanco o blanco amarillento se consideran no viables. Embriones que se tiñan de rosado pálido uniforme pueden ser clasificados como semillas no viables, pero también como semillas con dormancia profunda. En este último caso la baja actividad metabólica de las semillas dormantes no permite su tinción rosa intenso (Vivrette y Meyr, 2002Vivrette N, Meyr A. 2002. Testiing native species with deep dormancy. Seed Technology. 24: 43-51.). La velocidad de reducción del tetrazolio también se ve afectada por la concentración de la solución, la temperatura de incubación, la duración del preacondicionamiento y la tinción y el nivel de deterioro de las semillas (Da Costa y Marcos-Filho, 1994Da Costa NP, Marcos-Filho J. 1994. Alternative methodology for the Tetrazolium test soybean seeds. Seed Science and Technology. 22: 9-17.). De este modo, se propone que el procedimiento de tetrazolio debe ser estandarizado para cada especie, para obtener los mejores resultados, y en casos necesarios combinar sus resultados con ensayo de corte para evitar falsos negativos (Baskin y Baskin, 2014Baskin CC, Baskin JM. 2014. Seeds: Ecology, Biogeography and Evolution of Dormancy and Germination. Academic Press, New York.). El tetrazolio se emplea en concentraciones entre 0.1 al 1% (Baskin y Baskin, 2014Baskin CC, Baskin JM. 2014. Seeds: Ecology, Biogeography and Evolution of Dormancy and Germination. Academic Press, New York.); pero generalmente la concentración más utilizada es al 1% (10 g del tetrazolio en 1000 ml de agua destilada).

Se deben emplear entre 50 a 100 semillas para realizar la prueba de tetrazolio, o bien tres réplicas de 25 o 50 semillas cada una. Los pasos para la tinción de los embriones son los siguientes: 1) sumergir las semillas en agua, durante 12 a 24 horas, para favorecer su hidratación y con ello, la actividad de las enzimas deshidrogenasas; 2) realizar un corte transversal o pinchazo de las semillas para facilitar la entrada de la solución de TZ en el embrión; 3) incubar las semillas en oscuridad por uno o dos días en un rango de 25-35ºC, o bien a temperatura ambiente y 4) contar las semillas que muestran tinción en el embrión conforme a la coloración descrita previamente. Los resultados del ensayo de tetrazolio se expresan como porcentaje de semillas viables o porcentajes de semillas muertas con relación al total de semillas empleadas.

Prueba de germinación

Una prueba de germinación a temperatura ambiente bajo luz difusa se considera la técnica más directa para comprobar la viabilidad inicial de las semillas (Davies et al., 2015Davies R, Di Sacco A, Newton R. 2015. Germination testing: procedure and evaluation. Technical Information Sheet-13a. Millennium Seed Bank Partnership, Kew.). Sin embargo, cuando las semillas no germinan hay que combinar esta prueba con un ensayo de corte para determinar la cantidad de semillas vivas no germinadas (o dormantes) al final del experimento. Se emplean tres réplicas de 25 o 50 semillas cada una y se colocan en placas de Petri sobre papel de filtro humedecido con agua destilada durante cuatro semanas (Baskin y Baskin, 2014Baskin CC, Baskin JM. 2014. Seeds: Ecology, Biogeography and Evolution of Dormancy and Germination. Academic Press, New York.), y lo ideal sería emplear las condiciones óptimas de germinación para cada especie. Los resultados de la prueba de germinación se expresan en porcentaje de germinación final con relación al número de semillas sembradas o viables.

Contenido de humedad inicial

El contenido de humedad de las semillas es la cantidad de agua que hay en una semilla, que puede estar presente en forma libre o combinada con los compuestos químicos de las células (Bewley y Black, 1994Bewley JD, Black M. 1994. Seed: physiology of development and germination. Plenum Press, New York.), y debe ser el primer rasgo morfofisiológico a determinar una vez procesadas las semillas para evitar pérdidas de la humedad. El método gravimétrico es la forma más tradicional para medir el contenido de humedad de las semillas (ISTA, 2007ISTA (International Seed Testing Association). 2007. International rules for seed testing. Bassersdorf, Zürich.). Esta técnica es destructiva y requiere precisión en el pesaje de las semillas para certificar sus resultados. Consiste en determinar la masa fresca y seca de las semillas en una balanza analítica digital (si es posible con precisión10^-4g). Para registrar la masa seca de las semillas se puede emplear el método de secado a baja temperatura constante a 103 ± 2ºC por 17 horas, o bien el método de alta temperatura a 130 ± 2ºC durante 2, 3 o 4 horas (ISTA, 2007ISTA (International Seed Testing Association). 2007. International rules for seed testing. Bassersdorf, Zürich.). Previo al pesaje, las semillas secas deben permanecer al menos 20 minutos en un desecador (o campana cerrada con gel de sílice) a temperatura ambiente para estabilizar su peso. Esta variable se calcula mediante la siguiente fórmula:

Donde CH representa el contenido de humedad, mientras que MFS y MSS indican la masa fresca y seca de la semilla, respectivamente. El número de réplicas a utilizar depende básicamente de la cantidad de semillas recolectadas y de su tamaño. Siempre que el tamaño de las semillas lo permita, la masa fresca y seca de las semillas deben determinarse individualmente (i.e., por unidad de dispersión) con una muestra entre 25 a 100 semillas. Mientras que si son semillas muy pequeñas (< 2 mg) se aconseja tomar tres o cinco réplicas de varias semillas cada una, y el número de semillas por réplica dependerá de la especie. En el caso de que las unidades de dispersión sean frutos de tipo drupa o baya, debe retirarse el mesocarpo previo a la determinación de su masa fresca y seca, y cuando las semillas posean testas muy duras se aconseja romperlas o hacerles cortes para facilitar la determinación del contenido de humedad inicial (Gold y Hay, 2014Gold K, Hay F. 2014. Identifying desiccation-sensitive seeds. Technical Information Sheet-10. Millennium Seed Bank Partnership, Kew.).

Masa y forma de la semilla

Distribución de la biomasa seminal

Para calcular la fracción de la masa seca seminal destinada a las estructuras de cubiertas (testa/endocarpo) o reservas (embrión/endospermo) se divide el valor de cada componente entre la masa seca total de la unidad de dispersión. La masa seca total de la unidad de dispersión resulta de la suma de sus dos partes componentes (Pritchard et al., 2004bPritchard HW, Daws MI, Fletcher BJ, Gaméné CS, Msanga HP, Omondi W. 2004b. Ecological correlates of seed desiccation tolerance in tropical African dryland trees. American Journal of Botany. 91: 863-870.; Daws et al., 2006Daws MI, Garwood NC, Pritchard HW. 2006. Prediction of desiccation sensitivity in seeds of woody species: a probabilistic model based on two seed traits and 104 species. Annals of Botany. 97: 667-674.). Estas variables se calculan mediante las siguientes fórmulas:

Donde MRC y MRR representan la masa relativa de las cubiertas y las reservas respectivamente, MSS se refiere en este caso a la masa seca total de la unidad de dispersión, mientras que MSC y MSR indican la masa seca de las estructuras de las cubiertas (i.e. endocarpo y testa) y las reservas (i.e. embrión y endospermo) seminales en el mismo orden. Según Daws et al. (2006)Daws MI, Garwood NC, Pritchard HW. 2006. Prediction of desiccation sensitivity in seeds of woody species: a probabilistic model based on two seed traits and 104 species. Annals of Botany. 97: 667-674., se debe emplear un mínimo de 8 semillas (o unidad de dispersión) para determinar individualmente estas variables; pero otros autores recomiendan 25 o 100 semillas por especie (Pritchard et al., 2004bPritchard HW, Daws MI, Fletcher BJ, Gaméné CS, Msanga HP, Omondi W. 2004b. Ecological correlates of seed desiccation tolerance in tropical African dryland trees. American Journal of Botany. 91: 863-870.; Sánchez et al., 2018Sánchez JA, Pernús M. 2018. Tratamientos de semillas. En: Sánchez JA, Furrazola E. (eds.), Ecotecnologías para la restauración ecológica: los tratamientos de semillas y micorrizas, 5-54, Editorial Academia, La Habana.). También se puede calcular la fracción destinada a otras partes de la semilla/fruto, por ejemplo al embrión o al endospermo con relación a la masa seca total de la unidad de dispersión. Los valores resultantes de todas estas variables representan una proporción, pero se pueden multiplicar por 100 para facilitar su interpretación.

Permeabilidad de las semillas

Para determinar si las semillas son permeables al agua, un simple experimento de imbibición (o prueba de permeabilidad) se debe realizar con semillas frescas e intactas (no escarificadas). Esta variable se calcula para tres réplicas de 25 semillas cada una, pero igual se puede establecer para cada unidad de dispersión. Las semillas se colocan en placas Petri sobre papel de filtro humedecido con agua destilada a temperatura ambiente. La masa de las semillas se determina previo a su imbibición en agua (tiempo cero) y posterior a su contacto con el agua durante los tiempos de imbibición que establezca el investigador. Se puede utilizar una secuencia de tiempos (e.g., desde 24 hasta 96 horas) o un solo tiempo de imbibición (e.g., 24 horas). El porcentaje de incremento en masa de las semillas se calcula por la siguiente fórmula propuesta por Baskin et al. (2004)Baskin JM, Davis BH, Baskin CC, Gleason SM, Cordell S. 2004. Physical dormancy in seeds of Dodonea viscosa (Sapindales. Sapindaceae) from Hawaii. Seed Science Research. 14: 81-90.:

Donde IMS (%) se refiere al porcentaje del incremento en masa de la semilla, MSH representa la masa de la semilla después del contacto con el agua y MFS₀ indica la masa fresca inicial de la semilla. Un considerable incremento en la masa de las semillas intactas (> 20%) (Martyn et al., 2021Martyn AJ, Offord CA, Meagher PF, Auld T, Bush D, Coates DJ. 2012. Seed dormancy and viability of endangered Eucalyptus species in relation to the timing of soil seed bank collection. In: Seeds of hope. Springer.) indica que las cubiertas seminales son permeables al agua; mientras que si las semillas no incrementan en masa, significa que sus cubiertas son impermeables al agua (Baskin et al., 2004Baskin JM, Davis BH, Baskin CC, Gleason SM, Cordell S. 2004. Physical dormancy in seeds of Dodonea viscosa (Sapindales. Sapindaceae) from Hawaii. Seed Science Research. 14: 81-90.). Este comportamiento igualmente se puede visualizar por medio de una curva de imbibición de semillas intactas y escarificadas (Fig. 4). Si las semillas intactas son impermeables al agua, entonces sucede un incremento significativo de su masa cuando son sometidas a tratamientos de escarificación. El incremento en masa de las semillas escarificadas suele ser muy rápido como ocurre en muchas semillas de Fabaceae (Baskin y Baskin, 2014Baskin CC, Baskin JM. 2014. Seeds: Ecology, Biogeography and Evolution of Dormancy and Germination. Academic Press, New York.). Pero en otras especies este proceso es lento e irregular, lo cual depende de las características inherentes de las semillas de cada especie (o lote) y de las condiciones ambientales durante la imbibición (Bewley y Black, 1994Bewley JD, Black M. 1994. Seed: physiology of development and germination. Plenum Press, New York.). Por consiguiente, el típico patrón trifásico de absorción de agua que se presenta en muchas semillas cultivadas sin dormancia (Bewley y Black, 1994Bewley JD, Black M. 1994. Seed: physiology of development and germination. Plenum Press, New York.), en ocasiones no se observa para semillas de especies silvestres (Pereira et al., 2022Pereira WVS, Jose AC, Tonetti OAO, de Melo LA, Faria JMR. 2022. Imbibition curve in forest tree seeds and the triphasic pattern: theory versus practice. South African Journal of Botany. 144: 105-114.).

Tipos de embriones y relación embrión/semilla (E:S)

El tipo de embrión que puede presentar una semilla tiene implicaciones relevantes en la dormancia y germinación (Finch-Savage y Leubner-Metzger, 2006Finch-Savage WE, Leubner-Metzger G. 2006. Seed dormancy and the control of germination. New Phytologist. 171: 501-523.; Mattana et al., 2014Mattana E, Stuppy WH, Fraser R, Waller J, Pritchard HW. 2014. Dependency of seed dormancy types on embryo traits and environmental conditions in Ribes species. Plant Biology. 16: 740-747.). La descripción de los tipos de embriones se efectúa por su morfología (forma) y grado de desarrollo mismo (tamaño) (Martin, 1946Martin AC. 1946. The comparative internal morphology of seeds. The American Midland Naturalist. 36: 513-660.; Baskin y Baskin, 2007Baskin CC, Baskin JM. 2007. A revision of Martin’s seed classification system, with particular reference to his dwarf-seed type. Seed Science Research 17: 11-20.). Según este criterio de clasificación, Baskin y Baskin (2007)Baskin CC, Baskin JM. 2007. A revision of Martin’s seed classification system, with particular reference to his dwarf-seed type. Seed Science Research 17: 11-20. documentan 13 tipos de embriones, que se identifican por la clave dicotómica propuesta por dichos autores (Tabla 2).

El desarrollo del embrión se determina a partir de la relación entre el largo del embrión con respecto al largo interno de la semilla (E:S). Para determinar la relación E:S se puede utilizar una muestra de 20 o 30 semillas a las que se les realizan cortes longitudinales con bisturí o pinzas, para medir la longitud del embrión con respecto al largo de la semilla (Baskin y Baskin, 2007Baskin CC, Baskin JM. 2007. A revision of Martin’s seed classification system, with particular reference to his dwarf-seed type. Seed Science Research 17: 11-20.). Se considera que una semilla presenta embrión poco desarrollado cuando este es pequeño, pero tiene órganos diferenciados (i.e., radícula y cotiledones), y la relación entre el tamaño del embrión con respecto al largo total de la semilla (E:S) solo abarca una fracción (E:S ≤ 0.5). Estos embriones, según su forma, pueden ser rudimentarios, lineales o espatulados, aunque es válido aclarar que no todas las semillas con embriones pequeños (baja E:S) son subdesarrollados (Baskin y Baskin, 2005Baskin CC, Baskin JM. 2005. Underdeveloped embryos in dwarf seeds and implications for assignment to dormancy class. Seed Science Research. 15: 357-360.). Los embriones subdesarrollados deberán crecer antes de que ocurra la emergencia de la radícula. Por su parte, se considera que un embrión es totalmente desarrollado cuando ocupa más del 50% de la cavidad seminal (E:S > 0.5), o la totalidad de la semilla. Los embriones desarrollados pueden ser lineales, espatulados, invertidos, doblados o plegados.

Con la relación E:S también se puede determinar la dinámica de crecimiento del embrión, para la cual se toman los valores de esta relación en diferentes tiempos. Igualmente, el porcentaje de desarrollo del embrión hasta que rompe la testa (o endocarpo) se determina mediante la siguiente fórmula propuesta por Athugala et al. (2020)Athugala YS, Jayasuriya KMGG, Gunarathe AMTA, Baskin CC. 2020. Seed dormancy of 80 tropical montane forest species in Sri Lanka, the first dormancy profile for a tropical montane forest community. Plan Biology. 23: 293-299.:

Donde DE (%) representa el porcentaje de desarrollo del embrión, ET:ST indica la relación entre el embrión y la semilla cuando el embrión rompe la testa durante la germinación y E:S es la relación embrión/semilla inicial.

Baskin y Baskin (2014)Baskin CC, Baskin JM. 2014. Seeds: Ecology, Biogeography and Evolution of Dormancy and Germination. Academic Press, New York. señalan la importancia que tiene identificar el tipo de embrión de las semillas en la determinación de los mecanismos de dormancia que puede presentar cada especie. Se conoce que semillas con embriones rudimentarios, lineales subdesarrollados o espatulados subdesarrollados pueden tener dormancia morfológica (MD, por sus siglas en inglés) o dormancia morfofisiológica (MPD) (Baskin y Baskin, 2007Baskin CC, Baskin JM. 2007. A revision of Martin’s seed classification system, with particular reference to his dwarf-seed type. Seed Science Research 17: 11-20.). En cambio, semillas con embriones de tipo lineal desarrollado, espatulado desarrollado, invertido, doblado y plegado, pueden presentar semillas no dormantes, o con dormancia fisiológica (PD), dormancia física (PY) o dormancia combinada (PY+PD) (Baskin y Baskin, 2007Baskin CC, Baskin JM. 2007. A revision of Martin’s seed classification system, with particular reference to his dwarf-seed type. Seed Science Research 17: 11-20.). Por último, especies con embriones anchos, capitados, laterales o periféricos, pueden tener semillas no dormantes o con dormancia fisiológica (Baskin y Baskin, 2014Baskin CC, Baskin JM. 2014. Seeds: Ecology, Biogeography and Evolution of Dormancy and Germination. Academic Press, New York.; Martyn et al., 2021Martyn AJ, Offord CA, Meagher PF, Auld T, Bush D, Coates DJ. 2012. Seed dormancy and viability of endangered Eucalyptus species in relation to the timing of soil seed bank collection. In: Seeds of hope. Springer.).

En Cuba se ha documentado el tipo de embrión en más 100 especies nativas pertenecientes a árboles, arbustos y trepadoras (e.g., ver Montejo et al., 2014Montejo LA, Muñoz BC, Sánchez JA, Gamboa A. 2014. Variabilidad seminal entre las especies de un bosque siempreverde tropical de la Sierra del Rosario, Cuba. Bosque. 31: 37-47.; López et al., 2016López D, Gómez JL, Sánchez JA, González JL. 2016. Rasgos de semillas y germinación de Spirotecoma holguinensis (Bignoniaceae), árbol endémico de las serpentinas del este de Cuba. Revista del Jardín Botánico Nacional. 37: 191-201.; Pernús et al., 2020Pernús M, Sánchez JA, Álvarez JC. 2020. Germination strategies of three palms that coexist in the white sands of western Cuba. Palms. 64: 94-101.). Se registran 10 de los 13 tipos de embriones conocidos, siendo los tipos invertido, espatulado desarrollado y doblado los que se presentan con mayor frecuencia en especies arbóreas no pioneras y pioneras (Fig. 5 y 6), aunque en especies no pioneras también se han identificado embriones rudimentarios, lineales no desarrollados y espatulados no desarrollados (Montejo et al., 2014Montejo LA, Muñoz BC, Sánchez JA, Gamboa A. 2014. Variabilidad seminal entre las especies de un bosque siempreverde tropical de la Sierra del Rosario, Cuba. Bosque. 31: 37-47.; Sánchez et al., 2019Sánchez JA, Pernús M, Torres-Arias Y, Barrios D, Dupuig Y. 2019. Dormancia y germinación en semillas de árboles y arbustos de Cuba: implicaciones para la restauración ecológica. Acta Botánica Cubana. 218: 77-108. https://cu-id.com/2402/ojs290).

Tiempo y modo de dispersión

Procesamiento de datos

Para calcular muchos de los rasgos morfofisiológicos previamente comentados se puede emplear la planilla de Excel que recientemente proponen Sánchez et al. (2024)Sánchez JA, Gutiérrez A, Pernús M. 2024. Planilla de Excel para cálculo rápido de rasgos morfofisiológicos de semillas. Acta Botánica Cubana. 223. https://cu-id.com/2402/v223e04.. Esta herramienta calcula 18 rasgos funcionales de semillas con su estadística básica de tendencia central y dispersión.

Experimentos en condiciones de laboratorio

Muchos son los factores del ambiente, abióticos y bióticos que influyen en el funcionamiento de las semillas. Sin embargo, se reconoce que el agua, la temperatura y la iluminación son los principales factores del ambiente edáfico que intervienen en la germinación o eliminación de la dormancia de muchas plantas cultivadas o silvestres (Bewley et al., 2013Bewley JD, Bradford KJ, Hilhorst HWM, Nonogaki H. 2013. Seeds: Physiology of Development, Germination and Dormancy. Springer, New York.; Baskin y Baskin, 2014Baskin CC, Baskin JM. 2014. Seeds: Ecology, Biogeography and Evolution of Dormancy and Germination. Academic Press, New York.). Por tanto, conocer cómo dichos factores regulan los mecanismos de germinación permitirá tener mayor éxito en la propagación de las plantas nativas. También sería factible realizar ensayos de germinación bajo condiciones de estrés hídrico y salinidad, e igual convienen determinar los requerimientos germinativos de cada especie en un escenario multifactorial.

Procedimientos experimentales generales

Las semillas recolectadas se mezclan y se siembran dentro de los tres primeros días después de su limpieza. Previo a la siembra se determina la viabilidad inicial de las semillas (por pruebas de Tetrazolio o cortes), y la permeabilidad de las semillas por ensayos de imbibición. Las semillas antes de la siembra se esterilizan con hipoclorito de sodio (1%, 10 min) para prevenir la contaminación fúngica. Cinco réplicas de 25 o 50 semillas cada una se pueden emplear por tratamiento (ISTA, 2007ISTA (International Seed Testing Association). 2007. International rules for seed testing. Bassersdorf, Zürich.), pero se pueden usar dos réplicas de 13 semillas cada una para pruebas de germinación simples de especies amenazadas que produzcan pocas semillas (Pritchard et al., 2004aPritchard HW, Wood CB, Hodges S, Vautier HJ. 2004a. 100-seed test for desiccation tolerance and germination: a case study on eight tropical palm species. Seed Science and Technology. 32: 393-403.). La siembra se realiza sobre papel de filtro en placas de Petri esterilizadas de diferentes tamaños en correspondencia con el tamaño de la semilla. También se pueden emplear como medio de siembra el agar hidrostático al 1%, la arena, el algodón, las toallas de papel y el suelo del sitio de recolecta. La elección de un medio u otro dependerá de las características de las semillas de cada especie y de los objetivos del investigador.

La duración de cada experimento de germinación depende de los intereses del estudio que se realice, aunque está establecido que 30 días es tiempo suficiente para determinar la presencia de dormancia (Baskin y Baskin, 2014Baskin CC, Baskin JM. 2014. Seeds: Ecology, Biogeography and Evolution of Dormancy and Germination. Academic Press, New York.). En el caso de las semillas iluminadas, el conteo de germinación se efectúa diariamente, y para semillas expuestas a condiciones continuas de oscuridad total el conteo de la germinación se realiza tres días después de haber concluido la germinación a la luz. La localización de las placas en las incubadoras se debe cambiar regularmente, y el criterio para la germinación es la protrusión visible de la radícula. Al terminar las pruebas de germinación, a todas las semillas que no germinaron se les determina su viabilidad mediante la prueba de TZ o de corte (ISTA, 2007ISTA (International Seed Testing Association). 2007. International rules for seed testing. Bassersdorf, Zürich.), tal como se describió previamente.

Ensayo en diferentes condiciones de temperaturas y luz

Se recomienda diseñar un experimento factorial que simule las variaciones de luz y temperatura que sufren las semillas al llegar al suelo desde el dosel de la vegetación hasta un claro. En Cuba, para especies de bosques siempreverdes estacionales y bosques semideciduos se han ensayado cinco escenarios de temperaturas y dos de iluminación. Se emplea una temperatura constante de 25ºC y cuatro regímenes de temperatura alterna de 25/30ºC, 25/35ºC, 25/40ºC y 25/45ºC (8 horas para la temperatura más alta del termoperíodo y 12 horas a 25ºC, con transición entre estas de 4 horas). Los tratamientos de iluminación serán: exposición a la luz (8 horas de aproximadamente 40 µmol m^-2 s^-1, longitud de 400-700 nm) coincidente con el período de mayor temperatura dentro de cada termoperíodo; y oscuridad constante, que se logra envolviendo las placas con semillas en dos capas de papel de aluminio.

Por su parte, en el caso de plantas que habitan sitios más abiertos (e.g., matorrales), la alternancia de temperatura a emplear debe ser mayor que la descrita para los bosques cubanos. Por consiguiente, se debe caracterizar el clima del sitio de recolecta, para obtener valores promedios de las temperaturas máximas y mínimas por meses. Dicha información también se puede obtener de estaciones meteorológicas cercanas al área de estudio, o bien de datos bioclimáticos del WorldClim 2 (Fick y Hijmans, 2017Fick SE, Hijmans RJ. 2017. WorldClim 2: new 1-km spatial resolution climate surfaces for global land areas. International Journal of Climatology. 37: 4302-4315.). Igualmente, en los ensayos de germinación bajo diferentes condiciones de temperaturas y de luz se pueden emplear temperaturas que simulen posibles escenarios ambientales inducidos por el cambio climático (Sánchez et al., 2011Sánchez JA, Suárez AG, Montejo LA, Muñoz BC. 2011. El cambio climático y las semillas de las plantas nativas cubanas. Acta Botánica Cubana. 214: 38-50.; Dürr et al., 2015Dürr C, Dickie JB, Yang XY, Pritchard HW. 2015. Ranges of critical temperature and water potential values for the germination of species worldwide: Contribution to a seed trait database. Agricultural and Forest Meteorology. 200: 222-232.) y otras condiciones de iluminación a la que pueden estar expuestas las semillas; por ejemplo, bajo condiciones adversas de iluminación (luz roja lejana) (Baskin y Baskin, 2014Baskin CC, Baskin JM. 2014. Seeds: Ecology, Biogeography and Evolution of Dormancy and Germination. Academic Press, New York.; Sánchez et al., 2017Sánchez JA, Martínez J, Pernús M, Barrios D. 2017. Efecto de la temperatura y la iluminación sobre la germinación de semillas no dormantes de Guazuma ulmifolia (Malvaceae). Acta Botánica Cubana. 216: 116-121. https://cu-id.com/2402/ojs175). En caso de que no se cuente con incubadoras refrigeradas los ensayos de germinación se pueden realizar a temperatura ambiente de laboratorio siempre que se registre este factor, así como la iluminación.

Ensayo bajo estrés hídrico y salino

Las semillas se colocan en placas de Petri con papel de filtro que contengan agua destilada estéril o solución osmótica. Para crear estrés hídrico se utilizan soluciones de Manitol y de polietilenglicol (PEG-6000), y para estrés salino soluciones de cloruro de sodio (NaCl) y diferentes concentraciones de agua de mar. El potencial osmótico de las soluciones de Manitol y NaCl a una temperatura fija (seleccionada por el investigador) se calcula por la ecuación de van’t Hoff (Swagel et al., 1997Swagel EN, Bernhard AVH, Ellmore GS. 1997. Substrate water potential constraints on germination of the strangler fig Ficus aurea (Moraceae). American Journal of Botany. 84: 716-722.), y en el caso del PEG-6000 se utiliza la cantidad de soluto que recomiendan Villela et al. (1991)Villela FA, Filho LD, Sequeira EL. 1991. Tabela de potential osmotico em funҫão da concentraҫão de polietileno glicol 6.000 e da temperatura. Pesquisa Agropecuaria Brasileira. 26: 1957-1968. para cada temperatura y potencial osmótico. En los ensayos de germinación se establecen por lo general seis soluciones de los siguientes potenciales: 0 (agua), -0.20, -0.40, -0.60, -0.80 y 1.00 MPa, que representan rangos críticos de potenciales de agua para la germinación (Dürr et al., 2015Dürr C, Dickie JB, Yang XY, Pritchard HW. 2015. Ranges of critical temperature and water potential values for the germination of species worldwide: Contribution to a seed trait database. Agricultural and Forest Meteorology. 200: 222-232.).

Las placas de Petri deben sellarse para evitar variaciones del potencial osmótico, y en caso de que no se sellen las soluciones se cambiarán en días alternos. Algunos autores también recomiendan no emplear papel de filtro para mantener estables las soluciones (Hardegree y Emmerich, 1990Hardegree SP, Emmerich WE. 1990. Effect of polyethylene glycol exclusion on the water potential of solution-saturated filter paper. Plant Physiology. 92: 462-466.). Los experimentos bajo estrés hídrico y salino se pueden realizar en una sola temperatura fija del sustrato (Sánchez et al., 2003Sánchez JA, Muñoz BC, Montejo LA. 2003. Efectos de tratamientos robustecedores de semillas sobre la germinación y establecimiento de árboles pioneros bajo condiciones de estrés. Ecotropicos. 16: 91-112.; 2020Sánchez JA, Pernús M, Martínez J. 2020. Tratamientos de semillas para mejorar la germinación de Guazuma ulmifolia bajo estrés hídrico y calórico: comparación entre árboles tropicales pioneros. Revista Jardín Botánico Nacional. 41: 93-108.; Saedipour, 2010Saedipour S. 2010. Comparative Effects of NaCl and polyethylene Glycol on germination and early seedling growth of Safflower. International Journal of Applied Agricultural Research. 5: 251-260.); pero se recomienda emplear diferentes rangos de temperaturas para determinar los efectos combinados de las temperaturas con diferentes potenciales osmóticos sobre la germinación (Flores et al., 2017Flores J, Pérez RM, Jurado E. 2017. The combined effect of water stress and temperature on seed germination of Chihuahuan Desert species. Journal of Arid Environments. 146: 95-98.; Gurvich et al., 2017Gurvich DE, Pérez-Sánchez R, Bauk K, Jurado E, Ferrero MC, Funes G, et al, 2017. Combined effect of water potential and temperature on seed germination and seedling development of cacti from a mesic Argentine ecosystem. Flora. 227: 18-24.; Barrios et al., 2021Barrios D, Flores J, Sánchez JA, González-Torres LR. 2021. Combined effect of temperature and water stress on seed germination of four Leptocereus spp. (Cactaceae) from Cuban dry forests. Plant Species Biology. 36: 512-522.).

Ensayo de avance de diferentes temperaturas

Los ensayos de avance de diferentes temperaturas o move-along experiment se diseñaron para determinar los efectos de una secuencia de temperaturas para romper la dormancia profunda en semillas permeables al agua (Baskin y Baskin, 1998Baskin CC, Baskin JM. 1998. Seeds: Ecology, biogeography and evolution of dormancy and germination. Academic Press, San Diego.; 2003Baskin CC, Baskin JM. 2003. When breaking seed dormancy is a problem. Try a move-along experiment. Native Plants Journal. 4: 17-21.). Por lo tanto, previo al inicio de este experimento se debe determinar si las semillas intactas son permeables o no, y sí tienen dormancia. Estos experimentos son fáciles de hacer y no requieren de grandes volúmenes de semillas, pues un mismo lote de semillas se somete a varias secuencias de temperaturas para simular las variaciones de temperaturas que sufren las semillas cuando llegan al suelo. En Cuba, sería conveniente diseñar siembras en el laboratorio que simulen cambios de temperaturas desde finales de la estación de invierno hasta la llegada del verano, para determinar los efectos de la estratificación en caliente sobre la ruptura de la dormancia y la germinación. También se podrían implementar estudios de fenología de la germinación que muestren todas las variaciones ambientales (e.g., temperatura, humedad, luz) que sufren las semillas desde que llegan al suelo hasta su germinación.

Obtención de variables germinativas

Como rasgos germinativos se determinan el porcentaje de germinación final a la luz y a la oscuridad. En las semillas germinadas a la luz se realiza el conteo diario de la germinación, y se establece además el día de inicio de la germinación (DIG) y el coeficiente de velocidad de germinación (CVG) como medida de velocidad de germinación. El CVG se calculará para cada réplica dividiendo el número final de semillas germinadas (N) por la sumatoria del número de semillas germinadas en un día particular (n_i) multiplicado por el número de días correspondiente (d_i) desde el comienzo del experimento (Alm et al., 1993Alm DM, Stoller EW, Wax LM. 1993. An index model for predicting seed germination and emergence rates. Weed Technology Journal. 7: 560-769.): $CVG=N/\sum n_i{d}_i$ ; los valores de CVG se encuentran entre 0 (no germinación) y 1 (rápida velocidad de germinación). Todos los valores de velocidad de germinación se multiplicarán por 100 para facilitar la interpretación de los datos.

También se pueden determinar las seis variables germinativas que proponen Ranal et al. (2009)Ranal MA, Santana DG, Ferreira WR, Mendes-Rodrigues C. 2009. Calculating germination measurements and organizing spreadsheets. Brazilian Journal of Botany. 32: 849-855.. Estas variables son: porcentaje de germinación final (G), tiempo medio de germinación (TMG, días), velocidad media de germinación (VMG, días^-1), coeficiente de variación del tiempo medio de germinación (CVt, %), incertidumbre del proceso de germinación (U, bits) y sincronización del proceso de germinación (Z); que se calculan según las fórmulas descritas por Ranal y Santana (2006)Ranal MA, Santana DG. 2006. How and why to measure the germination process? Revista Brasileira de Botânica. 29: 1-11. y con la planilla electrónica elaborada por Ranal et al. (2009)Ranal MA, Santana DG, Ferreira WR, Mendes-Rodrigues C. 2009. Calculating germination measurements and organizing spreadsheets. Brazilian Journal of Botany. 32: 849-855.. Altos valores de TMG indican que se requiere mayor tiempo para alcanzar el 50% de las semillas germinadas. Los valores de la velocidad de germinación (VMG) se estiman como el recíproco del tiempo medio (TMG); por tanto, al aumentar el TMG disminuyen los valores de VMG que se encuentran entre 0 (no germinación) y 1 (rápida velocidad de germinación). Por su parte, bajos valores de U indican que la germinación está más concentrada en el tiempo, mientras que los valores Z miden el grado de superposición de la germinación (Ranal y Santana, 2006Ranal MA, Santana DG. 2006. How and why to measure the germination process? Revista Brasileira de Botânica. 29: 1-11.). Esta última variable puede alcanzar valores entre 1 (la germinación de todas las semillas ocurre en el mismo tiempo) y 0 (cuando al menos dos semillas germinan en tiempos diferentes).

Los porcentajes de germinación final a la luz y a la oscuridad de igual forma permiten calcular el índice de germinación relativa a la luz (GRL), que expresa los requerimientos de luz para la germinación (Milberg et al., 2000Milberg P, Andersson L, Thompson K. 2000. Large seeded species are less dependent on light for germination than small-seeded ones. Seed Science Research. 10: 99-104.). Este índice se calcula según la fórmula: GRL = GL/(GD + GL), donde GL = porcentaje de germinación a la luz, y GD = porcentaje de germinación a la oscuridad. Los valores del índice de GRL varían entre 0 (semillas que germinan solo en la oscuridad) y 1 (semillas que germinan solo a la luz). Para obtener el índice de GRL de cada especie se utilizará el rango de temperatura óptimo (i.e., aquel en el que la especie registra el mayor porcentaje de germinación en la luz u oscuridad). El índice de GRL varía entre 0 (germinación solo en oscuridad) y 1 (germinación solo a la luz) (Milberg et al., 2000Milberg P, Andersson L, Thompson K. 2000. Large seeded species are less dependent on light for germination than small-seeded ones. Seed Science Research. 10: 99-104.). Si el índice GRL es superior a 0.75 se considera que la especie es dependiente de la luz (fotoblástica positiva); si es menor a 0.25 se considera repelente de la luz (fotoblástica negativa); y si el valor está entre 0.25 y 0.75 se establece como indiferente a la luz (Funes et al., 2009Funes G, Díaz S, Venier P. 2009. La temperatura como principal determinante de la germinación en especies del Chaco seco de Argentina. Ecología Austral. 19: 129-138.).

Experimento en condiciones de vivero o campo

En el caso de los ensayos de germinación en vivero o en campo lo que se evalúa no es el porcentaje de germinación, sino el de emergencia de la plántula. La germinación sensu stricto ocurre en el interior de la semilla (Bewley et al., 2013Bewley JD, Bradford KJ, Hilhorst HWM, Nonogaki H. 2013. Seeds: Physiology of Development, Germination and Dormancy. Springer, New York.). Desde el punto de vista fisiológico, es suficiente la ruptura de la cubierta seminal por la radícula para dar concluido el proceso germinativo a nivel de laboratorio. Sin embargo, desde el punto de vista agronómico se requiere de plántulas sanas; por consiguiente, el criterio de germinación se amplía hasta la salida del epicótilo y exposición de los cotiledones. Como este proceso ocurre generalmente bajo tierra (i.e., la germinación), el nombre correcto para la evaluación de la cantidad de plántulas que emergen del sustrato, cuando la siembra se realiza en campo es: “pruebas de emergencia de plántulas”, y no como habitualmente se denomina refiriéndose a pruebas de germinación.

Al igual que en los ensayos de germinación en laboratorio, se debe tener en cuenta las simulaciones del ambiente. Es importante localizar o crear en cada área de vivero condiciones que permitan obtener variantes térmicas y lumínicas en los sustratos. Tres condiciones básicas resultan indispensables:

La creación de estas condiciones básicas debe realizarse de manera individual para cada vivero. Es imprescindible hacer mediciones frecuentes de temperatura, no solo para la creación de estos espacios dentro de un vivero, sino para conocer las posibles modificaciones en el porcentaje de plántulas a obtener debido a la importancia de la temperatura en los procesos germinativos y de crecimiento de las plantas. Además, las condiciones térmicas a simular también resultan particulares para cada vivero en dependencia de la época del año y de la localización del mismo. Con los resultados de las pruebas de emergencia de las plántulas también se puede calcular las variables propuestas por Ranal et al. (2009)Ranal MA, Santana DG, Ferreira WR, Mendes-Rodrigues C. 2009. Calculating germination measurements and organizing spreadsheets. Brazilian Journal of Botany. 32: 849-855..

Estratificación

Este tratamiento se utiliza para romper dormancia fisiológica o morfofisiológica, y consiste en colocar las semillas entre estratos que conservan la humedad, comúnmente arena, turba o vermiculita, en frío o calor. También hay tratamientos de estratificación en seco para eliminar dormancia física o dormancia fisiológica.

Escarificación

Un gran número de especies forestales no germinan debido a que la testa o cubierta seminal es dura o impide la entrada de agua (dormancia física), o bien la testa/endocarpo constituye una barrera mecánica para la emergencia de la radícula. Así, la escarificación es cualquier proceso que rompa, raye, altere mecánicamente o ablande las cubiertas de las semillas (o del fruto) para hacerlas permeables al agua y a los gases. Esta puede subdividirse en dos:

Lixiviación

Las semillas son remojadas en agua corriente con la finalidad de remover los inhibidores químicos presentes en la cubierta (para eliminar dormancia fisiológica). Este tratamiento también es empleado con el objetivo de ablandar la testa. El tiempo de remojo puede ser de 12, 24, 48 y hasta 72 horas, y en algunos casos, cambiándoles el agua con cierta frecuencia. Habitualmente el remojo se efectúa en agua a temperatura ambiente, pero también se han obtenido buenos resultados con agua caliente. En este último caso, las semillas se colocan en agua hirviendo, retirando inmediatamente el recipiente de la fuente de calor y se deja enfriar hasta que alcance la temperatura ambiente.

Hormonas y otros estimulantes químicos

Existen compuestos que estimulan la germinación, entre los más usados están: ácido giberélico, nitrato de potasio, etileno, citoquinas, entre otros. Todas estas sustancias se emplean a diferentes concentraciones y tiempos de exposición, dependiendo de la especie.

Tratamientos de hidratación-deshidratación de semillas (H/D)

En Cuba, los tratamientos pregerminativos de H/D se han aplicado en una gran diversidad de especies cultivas y silvestres (Sánchez y Pernús, 2018Sánchez JA, Pernús M. 2018. Tratamientos de semillas. En: Sánchez JA, Furrazola E. (eds.), Ecotecnologías para la restauración ecológica: los tratamientos de semillas y micorrizas, 5-54, Editorial Academia, La Habana.). Estos procedimientos se consideran tratamientos pregerminativos de tipo fisiológico porque influyen en muchos eventos bioquímicos-fisiológicos relacionados con la germinación, la longevidad, la dormancia, el crecimiento y los rendimientos de las plantas tanto bajo condiciones ecológicas óptimas como adversas. Dichos tratamientos se conocen fundamentalmente, en la terminología científica, como acondicionadores de semillas o seed priming, revigorizadores de semillas o seed reinvigoration y robustedores de semillas o seed hardening (Sánchez et al., 2001Sánchez JA, Orta R, Muñoz BC. 2001. Tratamientos pregerminativos de hidratación-deshidratación de las semillas y sus efectos en plantas de interés agrícola. Agronomía Costarricense. 25: 67-92.; 2006Sánchez JA, Muñoz BC, Hernández L, Montejo LA, Suárez A, Torres-Arias Y. 2006. Tratamientos robustecedores de semillas para mejorar la emergencia y el crecimiento de Trichospermum mexicanum, árbol tropical pionero. Agronomía Costarricense. 30: 7-26.), y los procedimientos completos de cómo se aplican dichos tratamientos se describen por Sánchez y Pernús (2018)Sánchez JA, Pernús M. 2018. Tratamientos de semillas. En: Sánchez JA, Furrazola E. (eds.), Ecotecnologías para la restauración ecológica: los tratamientos de semillas y micorrizas, 5-54, Editorial Academia, La Habana.. Básicamente su aplicación se corresponde con el nivel de hidratación que alcanzan las semillas conforme al patrón de imbibición de cada lote de semillas y los procesos pregerminativos que activan. La deshidratación se realizará a 25 ± 2ºC (45% de humedad relativa) durante 48 h hasta alcanzar aproximadamente el contenido inicial de humedad de las semillas (con base a la masa fresca).

Combinación de tratamientos

Muchas son las combinaciones de tratamientos que pueden generarse de acuerdo a los requerimientos de las semillas y a los propósitos de los investigadores; aunque por lo general, se emplean en semillas que tengan más de un tipo de dormancia. Quizás la combinación más común que se pueda aplicar en semillas de especies arbóreas tropicales es un método de escarificación (mecánica o ácida) con un tratamiento pregerminativo de H/D. Ambos tratamientos son efectivos para mejorar la germinación y el posterior desarrollo de las plantas. Sin embargo, las combinaciones de tratamientos suelen ser más complejas, y se basan fundamentalmente en las tecnologías disponibles y en los conocimientos que tengan los productores de semillas sobre ecofisiología vegetal y las respuestas de las plantas al estrés. Estas combinaciones podrían ser muy diversas, pero todas deben ser superiores a un simple tratamiento, para que justifique su coste de producción y mejore las oportunidades de germinación y de establecimiento. Además, en especies silvestres tropicales probablemente se requiera de una estandarización previa para cada lote de semillas, dado la gran diversidad de formas, tamaños y tipos funcionales de semillas que existe en diferentes lotes de una misma especie o variedad, e incluso dentro de un mismo lote.

Flotación

Si bien no constituye un tratamiento pregerminativo per se, la separación de las semillas vanas de las semillas llenas es aconsejable como un primer paso previo a la determinación de los requerimientos germinativos, clases de dormancia y aplicación de tratamientos pregerminativos. La semilla vana o vacía por lo general corresponde a la porción que queda flotando en superficie. Pero se debe tener una noción previa de la especie, pues hay semillas que naturalmente usan las corrientes de agua como medio de dispersión y presentan alta flotabilidad. Siempre es recomendable realizar cortes a las semillas que flotan para conocer si se trata de semillas vanas o semillas con flotabilidad.

Modelos de tolerancia a la desecación

Para predecir la tolerancia a la desecación (o conducta de almacenamiento) de las semillas de forma rápida y segura se sugieren dos modelos probabilísticos que emplean datos biométricos de las semillas. Uno fue desarrollado por Daws et al. (2006)Daws MI, Garwood NC, Pritchard HW. 2006. Prediction of desiccation sensitivity in seeds of woody species: a probabilistic model based on two seed traits and 104 species. Annals of Botany. 97: 667-674. y el otro por Pelissari et al. (2018)Pelissari F, Cleiton A, Leite MA, Batista AC, Souza WV, Rocha JM. 2018. A probabilistic model for tropical tree seed desiccation tolerance and storage classification. New Forests. 49: 143-158.. Ambos modelos se han validado en especies arbóreas tropicales con un amplio rango de masa de la semilla (0.01 mg a 24 g) (e.g., Lan et al., 2014Lan QY, Xia K, Wang XF, Liu JW, Zhao J, Tan YH. 2014. Seed storage behavior of 101 woody species from the tropical rainforest of southern China: test of the seed-coat ratio-seed mass (SCR-SM) model for determination of desiccation sensitivity. Australian Journal of Botany. 62: 305-311.; Sánchez et al., 2018Sánchez JA, Pernús M. 2018. Tratamientos de semillas. En: Sánchez JA, Furrazola E. (eds.), Ecotecnologías para la restauración ecológica: los tratamientos de semillas y micorrizas, 5-54, Editorial Academia, La Habana.); aunque el modelo de Daws et al. (2006)Daws MI, Garwood NC, Pritchard HW. 2006. Prediction of desiccation sensitivity in seeds of woody species: a probabilistic model based on two seed traits and 104 species. Annals of Botany. 97: 667-674. ha sido más empelado a nivel mundial en diferentes formas de vida (Sommerville et al., 2021Sommerville KD, Errington G, Newby Z-J, Liyanage GS, Offord CA. 2021. Assessing the storage potential of Australian rainforest seeds: a decision-making key to aid rapid conservation. Biodiversity and Conservation. 30: 3185-3218.).

En el modelo propuesto por Daws et al. (2006)Daws MI, Garwood NC, Pritchard HW. 2006. Prediction of desiccation sensitivity in seeds of woody species: a probabilistic model based on two seed traits and 104 species. Annals of Botany. 97: 667-674., la probabilidad de la sensibilidad a la desecación P(D-S) de las semillas se obtiene de acuerdo a la fórmula:

Donde a representa la fracción de la masa seminal destinada a las cubiertas seminales (es decir la masa relativa de la cubierta descrita previamente, MRC) y b es el log10 de la masa seca total de la semilla (g).

En el modelo de Pelissari et al. (2018)Pelissari F, Cleiton A, Leite MA, Batista AC, Souza WV, Rocha JM. 2018. A probabilistic model for tropical tree seed desiccation tolerance and storage classification. New Forests. 49: 143-158., la probabilidad de la tolerancia a la desecación P(TD) de las semillas se calcula mediante la siguiente fórmula:

Donde A representa el contenido humedad inicial de la semilla, B la MRC y C es la masa seca total de la semilla (g).

El modelo propuesto por Pelissari et al. (2018)Pelissari F, Cleiton A, Leite MA, Batista AC, Souza WV, Rocha JM. 2018. A probabilistic model for tropical tree seed desiccation tolerance and storage classification. New Forests. 49: 143-158., conlleva el cálculo del contenido de humedad inicial del embrión + endospermo. Sin embargo, esta variable se hace difícil establecer para semillas de muchas especies, por lo que Sánchez et al. (2018)Sánchez JA, Pernús M. 2018. Tratamientos de semillas. En: Sánchez JA, Furrazola E. (eds.), Ecotecnologías para la restauración ecológica: los tratamientos de semillas y micorrizas, 5-54, Editorial Academia, La Habana. la sustituyen por el contenido de humedad inicial de las semillas como se describe arriba. De hecho, ambos contenidos de humedad están correlacionados positivamente entre sí (Pelissari et al., 2018Pelissari F, Cleiton A, Leite MA, Batista AC, Souza WV, Rocha JM. 2018. A probabilistic model for tropical tree seed desiccation tolerance and storage classification. New Forests. 49: 143-158.; Sánchez et al., 2018Sánchez JA, Pernús M. 2018. Tratamientos de semillas. En: Sánchez JA, Furrazola E. (eds.), Ecotecnologías para la restauración ecológica: los tratamientos de semillas y micorrizas, 5-54, Editorial Academia, La Habana.); y es más fácil calcular el contenido de humedad de las semillas intactas, que separar previamente el embrión + endospermo, para luego calcular su contenido de humedad. Según Sánchez et al. (2018)Sánchez JA, Pernús M. 2018. Tratamientos de semillas. En: Sánchez JA, Furrazola E. (eds.), Ecotecnologías para la restauración ecológica: los tratamientos de semillas y micorrizas, 5-54, Editorial Academia, La Habana., en 32 especies nativas cubanas los resultados obtenidos son similares para este índice cuando se calculan por ambas variables de contenido de humedad.

En los dos modelos se considera probable que las semillas sean sensibles a la desecación (i.e., recalcitrantes), si los valores de P son superiores a 0.5; y tolerantes a la desecación, si los valores de P son inferiores a 0.5 (i.e., ortodoxas). Un mínimo de 8 a 15 semillas por especie se recomienda por Daws et al. (2006)Daws MI, Garwood NC, Pritchard HW. 2006. Prediction of desiccation sensitivity in seeds of woody species: a probabilistic model based on two seed traits and 104 species. Annals of Botany. 97: 667-674. y Pelissari et al. (2018)Pelissari F, Cleiton A, Leite MA, Batista AC, Souza WV, Rocha JM. 2018. A probabilistic model for tropical tree seed desiccation tolerance and storage classification. New Forests. 49: 143-158., respectivamente para determinar estos modelos; pero Sánchez et al. (2018)Sánchez JA, Pernús M. 2018. Tratamientos de semillas. En: Sánchez JA, Furrazola E. (eds.), Ecotecnologías para la restauración ecológica: los tratamientos de semillas y micorrizas, 5-54, Editorial Academia, La Habana. proponen emplear entre 50 a 100 semillas por especie, pues se conoce que la sensibilidad o tolerancia a la desecación puede ser muy variable entre y dentro lotes de semillas de una misma especie (Ellis et al.,1991Ellis RH, Hong TD, Roberts EH, Soetisna U. 1991. Seed storage behaviour in Elaeis guineensis. Seed Science Research. 1: 99-104.; Souza et al., 2016Souza PP, Motoike SY, Carvalho M, Kuki KN, Borges EEI, Silva AM. 2016. Storage on the vigor and viability of macauba seeds from two provenances of Minas Gerais State. Ciência Rural. 46: 1932-1937.). Estos dos índices también se pueden calcular por la planilla de Excel que propone Sánchez et al. (2024)Sánchez JA, Gutiérrez A, Pernús M. 2024. Planilla de Excel para cálculo rápido de rasgos morfofisiológicos de semillas. Acta Botánica Cubana. 223. https://cu-id.com/2402/v223e04..

Esquema predictivo para evaluar la conducta de almacenamiento

Recientemente Sommerville et al. (2021)Sommerville KD, Errington G, Newby Z-J, Liyanage GS, Offord CA. 2021. Assessing the storage potential of Australian rainforest seeds: a decision-making key to aid rapid conservation. Biodiversity and Conservation. 30: 3185-3218. presentan un esquema predictivo para la identificación de la conducta de almacenamiento de las semillas para cuando estas son escasas y difíciles de germinar. El procedimiento original creado por estos autores contiene siete pasos que funcionan como una clave, pero a continuación se muestra una versión modificada con solo cinco pasos (Tabla 4). También del esquema original se propone sustituir el índice de tolerancia/sensibilidad a la desecación de Daws et al. (2006)Daws MI, Garwood NC, Pritchard HW. 2006. Prediction of desiccation sensitivity in seeds of woody species: a probabilistic model based on two seed traits and 104 species. Annals of Botany. 97: 667-674. por el de Pelissari et al. (2018)Pelissari F, Cleiton A, Leite MA, Batista AC, Souza WV, Rocha JM. 2018. A probabilistic model for tropical tree seed desiccation tolerance and storage classification. New Forests. 49: 143-158., este último tiene mayor precisión en especies arbóreas tropicales (Sánchez et al., 2018Sánchez JA, Pernús M. 2018. Tratamientos de semillas. En: Sánchez JA, Furrazola E. (eds.), Ecotecnologías para la restauración ecológica: los tratamientos de semillas y micorrizas, 5-54, Editorial Academia, La Habana.).

Si con este esquema no se puede identificar la probable tolerancia/sensibilidad a la desecación de las semillas, se sugiere emplear el protocolo propuesto por Hong y Ellis (1996)Hong TD, Ellis RH. 1996. A protocol to determine seed storage behaviour. IPGRI Technical Bulletin No.1. International Plant Genetic Resources Institute, Rome. si hay suficientes semillas, o bien el protocolo propuesto por Pritchard et al. (2004a)Pritchard HW, Wood CB, Hodges S, Vautier HJ. 2004a. 100-seed test for desiccation tolerance and germination: a case study on eight tropical palm species. Seed Science and Technology. 32: 393-403. que solo consume 100 semillas. No obstante, una simple prueba de tolerancia a la desecación de las semillas igualmente permitirá conocer si son sensibles o tolerantes a la desecación, y en consecuencia su conducta de almacenamiento (Hong y Ellis, 1996Hong TD, Ellis RH. 1996. A protocol to determine seed storage behaviour. IPGRI Technical Bulletin No.1. International Plant Genetic Resources Institute, Rome.; Sommerville et al., 2021Sommerville KD, Errington G, Newby Z-J, Liyanage GS, Offord CA. 2021. Assessing the storage potential of Australian rainforest seeds: a decision-making key to aid rapid conservation. Biodiversity and Conservation. 30: 3185-3218.; Jaganathan, 2023Jaganathan GK. 2023. Seed storage, dormancy, and germination behavior in Lithocarpus glaber (Fagaceae). Forest Science. https://doi.org/10.1093/forsci/fxad026.). Conforme a Hong y Ellis (1996)Hong TD, Ellis RH. 1996. A protocol to determine seed storage behaviour. IPGRI Technical Bulletin No.1. International Plant Genetic Resources Institute, Rome., las semillas que fallan en germinar después de bajar su contenido de humedad hasta 10-12% son recalcitrantes.

Identificación de tipos de plántulas

El tipo funcional de plántula es un carácter categórico que puede ser utilizado para caracterizar la estrategia regenerativa de la planta. Garwood (1996)Garwood NC. 1996. Functional morphology of tropical tree seedlings. En: Swaine MD (ed.), The ecology of tropical tree seedlings, 59-130, Parthenon, New York. estableció las siguientes cinco categorías de plántulas basadas en tres características de los cotiledones con importancia ecológica (exposición, posición, función) (Fig. 7): (1) Fanerocotilar epígeo con cotiledones foliáceos (FEF); (2) Fanerocotilar epígeo con cotiledones de tipo reservante (FER); (3) Fanerocotilar hipógeo con cotiledones de tipo reservante (FHR); (4) Criptocotilar hipógeo con cotiledones de tipo reservante (CHR) y (5) Criptocotilar epígeo de tipo reservante (CER). Estos tipos de plántulas son el resultado de la combinación de las diferentes posibilidades en relación a la exposición del cotiledón (criptocotilar o fanerocotilar), posición (epígeo o hipógeo) y a su función (foliáceo o con almacenamiento de reservas).

La morfología de la plántula se describe cuando al menos cinco individuos desplieguen las dos primeras hojas verdaderas. Luego de esto las especies son asignadas a una de las categorías indicadas arriba en la presente sección y según se describe a continuación:

Se conoce que los tipos morfo-funcionales de plántulas se relacionan con otros caracteres de las plantas como tamaño de la semilla, cantidad de nutrientes de las semillas, capacidad de tolerancia a la herbívora (o defoliación), contenido de humedad de las semillas, etc. Por ejemplo, semillas de gran tamaño (o masa seminal) están relacionadas con plántulas con cotiledones de tipo reservante, mientras que semillas pequeñas con cotiledones foliáceos y fotosintetizantes. Las primeras a su vez tienden a presentar menor velocidad de crecimiento relativo y menos capacidad fotosintética. También el tipo de plántula es un rasgo filogenéticamente conservado (Ibarra-Manríquez et al., 2001Ibarra-Manríquez G, Martínez Ramos M, Oyama K. 2001. Seedling functional types in a lowland rain forest in México. American Journal of Botany. 88: 1801-1812.), pero puede cambiar dentro un mismo género como ocurre en especies de Prunus y Trichilia de un bosque siempreverde mesófilo de la Sierra del Rosario (Sánchez et al., 2013Sánchez JA, Montejo LA, Hernández L. 2013. Efectos del tamaño de la semilla y la herbivoría sobre el establecimiento de plántulas arbóreas en diferentes suelos. Revista Anales de la Academia de Ciencias de Cuba. 3: 1-29.). El tipo de plántulas más común en especies arbóreas tropicales es el fanerocotilar epígeo foliáceo (Garwood, 1996Garwood NC. 1996. Functional morphology of tropical tree seedlings. En: Swaine MD (ed.), The ecology of tropical tree seedlings, 59-130, Parthenon, New York.; Ibarra-Manríquez et al., 2001Ibarra-Manríquez G, Martínez Ramos M, Oyama K. 2001. Seedling functional types in a lowland rain forest in México. American Journal of Botany. 88: 1801-1812.; Sánchez et al., 2013Sánchez JA, Montejo LA, Hernández L. 2013. Efectos del tamaño de la semilla y la herbivoría sobre el establecimiento de plántulas arbóreas en diferentes suelos. Revista Anales de la Academia de Ciencias de Cuba. 3: 1-29.). Por lo general, este tipo funcional de plántula es típico de especies de rápido crecimiento y de estadios primarios de la sucesión como las especies pioneras, pero se presenta también en especies de estadios intermedios o finales de la sucesión.

Por su parte, para el caso de las palmas tres tipos morfológicos de plántulas se reconocen: remota-tubular, remota-ligular y adyacente ligular. Estos tipos de plántulas están determinados principalmente por la extensión variable del peciolo cotiledonar y la presencia o no de lígula (proyección distal de la vaina de la hoja) (Tomlinson, 1960Tomlinson PB. 1960. Essays on the morphology of palms. I. Germination and the seedling. Principes. 4: 56-61.; Henderson, 2006Henderson FM. 2006. Morphology and anatomy of palm seedling. The Botanical Review. 72: 273-329.).

Otros rasgos de plántulas

Las plántulas muestran gran variabilidad de vigor y tamaño entre especies arbóreas (Poorter y Garnier, 2007Poorter H, Garnier E. 2007. Ecological significance of inherent variation in relative growth rate and its components. En: Pugnaire FI, Valladares F. (eds.), Functional plant ecology, 67-100, CRC Press, London.; Sánchez et al., 2011-2012Sánchez JA, Muñoz BC, Montejo LA, Lescaille M, Herrera-Peraza RA. 2011-2012. Tamaño y nutrientes de semillas en 32 especies arbóreas de un bosque tropical siempreverde de Cuba y su relación con el establecimiento de las plántulas. Revista del Jardín Botánico Nacional. 32-33: 181-204.); por tanto, resulta interesante determinar su vigor y características de crecimiento. El vigor de las plántulas recién germinadas se puede determinar por diferentes expresiones biológicas. Sobresale la combinación del porcentaje de germinación final multiplicado por la masa seca o altura de las plántulas (Šerá, 2023Šerá B. 2023. Methodological contribution on seed germination and seedling initial growth tests in wild plants. Notulae Botanicae Horti Agrobotanic Cluj-Napoca. 51: DOI: http://doi.org/10.15835/nbha51213164.). También se pueden calcular variables de crecimiento, como la altura total, el área foliar, la distribución de la biomasa en las plántulas, la velocidad de crecimiento relativo en función de sus reservas seminales, y el índice de plasticidad fenotípica de las plantas bajo condiciones de estrés (Milberg et al., 1997Milberg, P. & Lamont, B. B. 1997. Seed/cotyledon size and nutrient content play a major role in early performance of species on nutrient poor soils. New Phytologist.137: 665-672.; Poorter y Garnier, 2007Poorter H, Garnier E. 2007. Ecological significance of inherent variation in relative growth rate and its components. En: Pugnaire FI, Valladares F. (eds.), Functional plant ecology, 67-100, CRC Press, London.; Valladares et al., 2000Valladares F, Wright SJ, Lasso E, Kitajima K, Pearcy RW. 2000. Plastic phenotypic response to light of 16 congeneric shrubs from a Panamanian rainforest. Ecology. 81: 1925-1936.). Todas estas variables permiten una caracterización más completa de las plántulas, y por lo general son fáciles de medir.